最近驚聞一位朋友因患一種名為肝豆（dòu）狀核變性的罕見病而離世，突感罕見病並不罕見，它往往就在我們身邊。因筆（bǐ）者對肝豆狀核變性研究有所涉獵，本文將對該病及其（qí）動物模型作簡要介紹。

01、首次發現及致（zhì）病機製

肝豆狀核變性又名Wilson病(Wilson’s disease，WD) ，1912年首次由Samuel Kinnear Wilson博士描述。該病表現為“漸進性豆（dòu）狀核退化”，在患（huàn）者的肝髒和大腦等器官中發現了過量的銅，該病在全球的患病率約為1/30000。經過多年研（yán）究，肝豆狀核變（biàn）性（WD）的發病機製已經研究的較為清楚，它是一種常染色體隱性遺傳銅代謝障礙疾病[1]。1993年三個獨立研究小（xiǎo）組幾乎同時發現了ATP7B基因為Wilson病的致病基因。該基因編碼銅轉運（yùn）P型 ATP酶 ( copper-transporting P-type ATPase，ATP7B)[2]，WD患者攜（xié）帶發生突變的ATP7B基因，血清銅藍蛋（dàn）白合成及正常的銅代謝過程發生障礙，過量的銅沉積在組織器官中，如（rú）肝髒、大腦、腎髒、角膜中，其中最常受累的是（shì）肝髒和神經係統[3]。

圖1.ATP7B蛋白結構圖

圖注：N-端包含六個結合銅的金屬結合結構域（MBD1-MBD6，青色）；參與Cu配（pèi）位的殘基在膜內的位置為（wéi）CPC、YN和MXXXS；位於（yú）C末端的（de）兩個（gè）亮氨酸基序（1459LL和1487LL）對（duì）胞吞作用和TGN從質膜重新定位（wèi）至（zhì）關重要[4]。

02、臨床表現及診斷

WD患者在臨床表現上（shàng）包（bāo）括嚴（yán）重程度不等的肝（gān）損傷、持續性（xìng）血（xuè）清轉氨酶升高、急性（xìng）或慢性肝炎、代償（cháng）期或失代償期肝硬化和暴發性肝功能衰（shuāi）竭等[5]。神經係統的表現以椎體外係病（bìng）變症狀為主，包括僵硬、震（zhèn）顫、運（yùn）動遲緩、構音障（zhàng）礙、吞咽障礙、舞蹈症狀、癲（diān）癇發作等，精神症狀包括躁狂、性格改變、抑鬱等[6, 7]。此外腎髒、血液係統及骨關節等器官係統，也會出現（xiàn）相應的臨床症狀和體征。

患者出現以下一些症狀或指標可供臨床診斷：

1. 角膜K-F環是某些WD患（huàn）者一個比較明顯（xiǎn）的特征。K-F環為角膜邊緣（yuán）的黃綠色或黃灰色色（sè）素環，一般在手電（diàn）筒側光照射下肉眼可見，7歲以下患者一般無法檢出角膜K-F環。

2. 肝脾檢查：肝功能血清轉氨酶、膽紅素升高和（或）白蛋白降低；肝脾B超：常顯示肝實質光點（diǎn）增粗、回聲增強甚至結節狀改（gǎi）變；部分患者脾髒腫大；肝髒MRI檢查常顯示肝脂質沉積、不規則結節及肝葉萎縮等。

3. 采用銅（tóng）代謝相關生化檢查，銅藍蛋（dàn）白<120mg/L，24小時尿銅≥100μg。

4. 顱腦MRI檢查主要表現為殼核、尾狀核頭部、丘腦、中（zhōng）腦、腦橋及小腦T1低（dī）信號、T2高信號（hào），少數情況下（xià）可出現T1高信號或T1、T2均（jun1）低信號。

5. 基（jī）因篩查：對於臨床證據不足但又高度懷疑WD的患者，篩查ATP7B基因致（zhì）病（bìng）變異對診斷具有指導意義。

圖2. 角膜邊緣黃色渾濁的K-F環

03、ATP7B突變類型及（jí）地理分布

ATP7B基因突變在不同種（zhǒng）族和地域中存在（zài）遺傳異質性。歐洲人群最常見的突變類型是14號（hào）外顯子（zǐ）上的 H1069Q突變，在意大利、瑞典和羅馬尼亞等（děng）地（dì）多見，臨床主要以錐體外係症狀為（wéi）主，如震顫、肌張力障礙、精（jīng）神症狀（zhuàng）等。亞洲人群最常見的突變類（lèi）型是（shì） 8號外（wài）顯子上的錯義突變R778L，以中國、韓國和日本最多見，臨床以肝髒方麵症狀為主，如肝功能異常、肝（gān）硬化、肝脾大等；其餘常見的還有 P992L、Q1399R等[8]。

04、肝（gān）豆狀核（hé）變性動（dòng）物模型

1. “毒乳”( toxic milk，TX)小鼠

肝豆狀核變性動物模型（xíng）中最（zuì）有名的是一種“毒乳”( toxic milk，TX)TX小鼠。 “毒乳”小鼠（shǔ）這一名稱源自雌性純合子TX小鼠乳汁（zhī）中缺（quē）乏銅，因此其哺乳的幼鼠在2周（zhōu）左右時會由於（yú）銅缺（quē）乏而死（sǐ）亡。後（hòu）續研究證明“毒乳”為ATP7B基因突（tū）變小鼠。

TX小鼠又（yòu）分為兩種，一種是1974年由Harold Rauch在DL近交（jiāo）係小鼠F68代（dài）中發（fā）現的（de）自然突變，後來（1996年）被鑒定為ATP7B基因外顯子20中（zhōng）4066位的A到G堿基變（biàn）化（huà），導致第八跨膜區M1356V（甲硫氨酸（suān）to纈氨酸）的改變。TX鼠於第3周（zhōu）開始出現銅在髒器的沉積，首先是肝髒（zāng）和腦，以肝髒為重，至（zhì）第4個月銅沉積最為顯著（zhe），可達對（duì）照組的60~80倍（bèi）。同期腎髒（zāng）亦有大量沉積。這種由肝至腦再到腎的銅沉積（jī）過程與WD患（huàn）者的一般（bān）臨床病程相（xiàng）似[9]。

另一種TX小鼠是1987年在傑克遜（xùn）實驗室的C3H/HeJ群體中出現的自然突變品係TX-J小鼠，現對外出（chū）售，編號001576。該突（tū）變小鼠是ATP7B基因外顯子8中2135位的G到A的堿基突（tū）變。與TX小鼠相似，TX-J小鼠與WD患者以相似的方式在肝髒（zāng）中積（jī）累銅，成年純合子TX-J小鼠會發展為肝硬化。

TX和TX-J小鼠不（bú）能完（wán）全模擬WD患者，其角（jiǎo）膜無K-F環；與WD患者的（de）肝髒損（sǔn）傷也有顯著差異；且沒有關於人類WD母親的嬰兒銅（tóng）缺乏現（xiàn）象的報告；另外TX小鼠缺乏明顯神經係（xì）統症狀，TX-J小（xiǎo）鼠也隻有（yǒu）輕微的行為異常。但TX和TX-J小鼠ATP7B mRNA的轉（zhuǎn）錄水平沒（méi）有明顯改（gǎi）變（biàn）且ATP7B基因功（gōng）能部（bù）分保留，並具有與WD患者相類似的病理過程和銅生化特（tè）征（zhēng），同時也由於其容易獲（huò）得，是目前使用最多的WD動物模型之一，廣（guǎng）泛應用於一些治療藥物的（de）試驗。

2. ATP7B基因修飾小鼠

利用同源重（chóng）組技術或（huò）CRISPR基因編輯技術敲除ATP7B基因第2外顯子（zǐ）獲得的ATP7B-/-基因（yīn）敲除小（xiǎo）鼠也越來越多的被用於WD研究（jiū）。ATP7B-/-基因敲除（chú）小鼠具有與人（rén）類WD和TX小鼠相似的銅沉積表型，但與TX鼠（shǔ）模型相比（bǐ）發病較早且肝損傷更嚴重（chóng），肝炎、壞死性炎症、膽管增殖、纖維化，甚至後續的腫瘤發生等症狀都比TX鼠更接近（jìn）人類WD的肝髒病理結（jié）果（guǒ）。

隨著（zhe）基因編輯技術的進展，采（cǎi）用（yòng）基因編輯工（gōng）具CRISPR/Cas9+ssDNA[10]，或（huò）采用堿基編輯（Base Editor）、先導編輯（Primer editor）技術，結合胚胎操作術可以較輕鬆地在小鼠ATP7B基因上構建與人類WD同（tóng）源的（de）突變位點。理論上可以獲得更接（jiē）近人（rén）類WD特征的小鼠模型。

3. LEC(Long–Evans Cinnamon)大鼠

LEC大鼠是一種近交係突（tū）變大鼠，最初是從Long–Evans大鼠群體中分離出來（lái）的，它的ATP7B基因在3’端編碼區缺失了900個堿（jiǎn）基，以及下遊未翻譯區缺失了約（yuē）400個堿基。LEC大（dà）鼠主要表現出自發性肝銅異常積聚伴隨低血清銅和低銅藍蛋白，大約4月齡時出現暴發性（xìng）肝炎或暴（bào）發性肝衰（shuāi）竭、轉氨酶和膽紅素升高，部分或大量肝細胞壞死，病死率至少30%～40%，存活下來的大鼠多在12月齡時發生肝纖維化並伴有肝細胞癌（ái）和膽管癌。由於肝病進展迅速（sù），LEC大鼠特別適合幹預治療研究，如各種（zhǒng）排銅絡合劑和幹細胞治療研究（jiū）等（děng）。

圖3. LEC(Long–Evans Cinnamon)大鼠

4. 其他（tā）大型（xíng）哺乳（rǔ）動物模型

一些大（dà）型哺乳動物在銅代謝方麵也存（cún）在遺傳缺陷，均表現出（chū）銅在肝髒（zāng）中積累和銅毒性，例（lì）如犬(杜賓犬、拉布拉多尋回犬（quǎn）、貝靈頓梗犬Bedlington Terrier)和北羅納（nà）德賽羊等。然而這些大型哺乳動物銅（tóng）代謝方麵（miàn）的（de）遺傳缺陷與人類WD並不相同（tóng），如貝靈頓梗犬，導致其肝銅積累的遺傳缺陷是由於COMMD1（MURR1）基因（yīn）39.7kb的（de）刪除，而非ATP7B基因，故作為人類WD模（mó）型的作用有其局限性[11, 12]。若能在大型哺乳動物甚至非人靈長類動物的ATP7B基因中（zhōng）引入突變，或將造就更好模擬人類WD的動物模型。

05、肝豆狀核變性的治療

在目前（qián）的治療方案中，WD患（huàn）者需進行終（zhōng）生治療，主要目標為治療銅過載。基本原（yuán）則包括低銅飲（yǐn）食：避免或限製富（fù）含銅的食物，如肝髒、水生貝殼類動物（wù）、堅果、巧克力、豆類、蘑菇等。藥物治療（liáo）方（fāng）麵以青黴胺、曲恩汀為代表的金屬絡合劑（jì）增加銅的排除，以鋅劑為（wéi）代表的藥物減少銅的吸收。治（zhì）療越早越好，患者通常不能停藥，因為治療中斷很可能導致失（shī）代償性肝損傷及神經不可逆損傷。

值得注意的是WD的藥物治（zhì）療有（yǒu）一定的（de）局限性，除需要終生治療外（wài），約1/3 WD患者用藥期間會出現與藥物相（xiàng）關的不良事件，導致不得不更換藥物，甚至可能導致治療（liáo）失敗，WD晚期導致的肝衰竭或失代償期肝硬化需（xū）要進行肝移植，這可能是最後的常規治療手段。

鑒於（yú）WD是非常明確的由ATP7B基因突變所致（zhì）的疾病，因此基因治療或許有廣闊的（de）前景。目前已有（yǒu）基於動物（wù）模型的WD基因治療研究。如Murillo等在（zài）研究中用編碼人ATP7B cDNA的AAV8載體轉（zhuǎn）導到ATP7B-/-小鼠模型的肝髒，發現治療後血（xuè）清轉（zhuǎn）氨酶降（jiàng）低，尿銅排泄量減少，血清（qīng）全血漿蛋白（bái）的正（zhèng）常化[13]。此外，2019年Liu等通過CRISPR/Cas9替換了小鼠模型中ATP7B基（jī）因的（de）第8外顯子（zǐ）[14]；2020年Michael等（děng）使用CRISPR/Cas9+ssODN的方（fāng）法（fǎ）糾正人類細（xì）胞（bāo）係中的ATP7B點突（tū）變[15]。筆者嚐試用一種ABE堿基編輯器輸入（rù）到TX-J小鼠肝髒，觀察到了小鼠血清轉氨酶降低，以及（jí）低比例的肝（gān）細胞ATP7B點突變被糾正（數（shù）據不展（zhǎn）示（shì））。總之，基因治療的進展為WD患者帶來了希望（wàng），但基因治療還處於基礎研究到臨床研究（jiū）轉化（huà）的階段，還有很多不成（chéng）熟的地（dì）方（fāng）需要不斷完善和革新。期望它將來能成為治療肝豆狀核變性的一線療法。

參考文（wén）獻：

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