齧齒（chǐ）類實驗動物是使（shǐ）用最多的實驗動物，其微生物質量控製一直是實驗（yàn）動物設施管理者的工作重點。每個設施都（dōu）有自己的動物健（jiàn）康（kāng）監測方案（àn），其中哨兵鼠（Soiled Bedding Sentinels, SBS）長期以來應用最為廣泛。但由於哨兵鼠方案本身存在的一些缺點，常常無法及時有（yǒu）效地（dì）監測微生物汙染的發生，且需要額外使用動物，並不符合3R原（yuán）則（詳見本號前期文章：哨兵鼠設置，你想知道的都在）。

近（jìn）幾年，國際上有越來越多的設施（shī）將環境樣本PCR檢測（Environmental Health Monitoring, EHM）作為哨兵鼠方案的補充或替（tì）代方案，以便更及時靈敏地（dì）監測動物（條件（jiàn））致病微生（shēng）物感染（rǎn）和攜（xié）帶狀況。我國（guó）也有少數設施采取這種監測方（fāng）案。該方案不僅提高了檢測的敏感性，還減少了動（dòng）物使用數量，同時在哨兵（bīng）鼠設置和飼養（yǎng）上的時間和金錢成本也得到了節省（shěng）。隨著該（gāi）方法的不斷優化和普及，哨兵鼠方案在歐美多國有逐（zhú）漸被（bèi）取代的趨勢。本文就（jiù）簡要介紹一下EHM方案。

1、EHM方案的采（cǎi）樣方式

EHM方案最早采用無菌拭子擦拭附著在出風（fēng）口的粉塵（Exhaust Air Dust，EAD），或用特定大小的紗布或濾紙固定在出風口初效過濾器上收集粉塵。後來泰尼百斯、Allentown等籠具公司設計（jì）了專門的（de）采樣（yàng）口/卡槽並配套使用采樣卡，使得樣本采（cǎi）集更加簡便，並標準（zhǔn）化。這兩種方法都需要廢氣排出時不能在籠盒水平進行空氣過濾。目前在美國、加拿大等國家這兩種方（fāng）法（fǎ）都是被普遍使用（yòng）的采樣方（fāng）式（shì）。

近幾（jǐ）年，將植絨拭（shì）子、濾紙等介質放入髒墊料盒中代替哨兵鼠（shǔ），通過充分接觸可能存在的病原微（wēi）生物進行采樣的方法也被逐（zhú）步采用（yòng）。該方法不僅適用於所有設計（jì）形式的籠具，同時還可有效避免由於籠架清洗不充分所殘留的核酸引起的假陽性（xìng）結果。

不論是使用哪（nǎ）種采樣方（fāng）式，獲取的樣本都（dōu）是用PCR方法檢測目標病原體（tǐ）核酸，而由於PCR方法（fǎ）的高敏感性，因此足（zú）以檢測到樣本中的微（wēi）量核酸（suān）。

Jensen, JAALAS, 2013

Miller, JAALAS, 2016

Mahabir, Lab Anim., 2018

Pettan-Brewer，JAALAS, 2020

Varela，JAALAS, 2022

2、檢測結果的準確性

在綜合（hé）分析了已公開發表的33篇（piān）文獻（xiàn）後發現，髒墊料（liào）哨兵鼠方案對各種病原體的總檢出率約76%，而EHM的檢出率約96%。（詳見表1）

目前小鼠肝炎病（bìng）毒、小鼠細小病毒、仙台病毒、嗜肺巴斯德杆菌、螺（luó）杆菌、鞭毛蟲、蟯蟲及（jí）蟎蟲等多種病原體都（dōu）已（yǐ）證實可在EAD樣本中準確（què）檢出。特別是其中有些病原體在髒墊（diàn）料哨兵鼠方案會漏檢，但卻可以成功通過（guò）EHM檢測到（dào），例如（rú）仙台病毒、嗜肺巴斯德杆菌、螺杆菌（jun1）、鼠阿米巴、蟯蟲等（děng）。但是（shì）也有一些病原體，尚（shàng）未證實可以檢出，或（huò）不同研究顯示其檢測效果尚有爭議，例如（rú）輪狀病毒、鏈球菌等。

表1：不同病原（yuán）體在髒墊料哨兵鼠和環（huán）境（jìng）樣本中的檢出情況

*：檢出某病原體的文章數量/評估某病原體的文章數量

3、歐美實驗動物設施EHM使用情（qíng）況

一項覆蓋美國、加拿大、歐洲（zhōu）、英國等多個（gè）國家和地區的111個動物設施（shī）的（de）調查報告顯示，在大（dà）小鼠的月度和季（jì）度常規健康監測中，有11%的（de）設施單獨使用EHM，41%的設施單獨使用髒墊料哨兵鼠，46%的設施（shī）使用多（duō）種方案組合，此外有2%的設施（shī）不進行常規健康監測。

對於檢疫期齧齒類動（dòng）物，由於有更高的時效性要求，有更多人會選擇EHM方案，在被調查的111個（gè）設施中，63%的機構單獨（dú）使用EHM，15%的設施單獨使用髒墊料哨兵鼠方案，14%的設施使用（yòng）多種方法組合，還有8%的設施不（bú）檢測（cè）檢（jiǎn）疫期動物。

由以上數據可以（yǐ）看出，目（mù）前在檢疫檢（jiǎn）測中，由於EHM可以（yǐ）更快反饋（kuì）結果，因而使用（yòng）更廣泛，但在常（cháng）規健（jiàn）康監測中用EHM將髒墊料哨兵鼠完全替代的還是少數（shù）。但業內人士普遍相信，隨著越（yuè）來越多的數據支持（chí）、廣泛的宣傳和專（zhuān）業（yè）指導，使用EHM方案的（de）設施數量會越來越多。

4、實施EHM監測前應該評估的內容

籠架和籠（lóng）盒構造可能是在（zài）實施EHM方案前最需要考慮的因素。如何采樣、采樣位置選擇將直接影響監測效果，因（yīn）此（cǐ）建議對於不同類型、不同廠家的籠具都應該充分驗證采樣時間、方式和位置後（hòu）再正式使用（yòng）。

如果設施中（zhōng）曾經發生過某（mǒu）種微生物汙染，或所使用的墊飼料中殘（cán）留某種微生（shēng）物的核酸，那籠架出風口粉塵樣本中就很可能存在其核酸片段，這（zhè）就會造成假陽性結果。例如，某設施在做驗證時發現在用出風口粉塵樣本檢（jiǎn）測時可以檢測到大量綠膿杆菌核（hé）酸，但最終證實動物並沒有感染，環境中也沒（méi）有活（huó）菌，而是（shì）所使用的飼料中存在綠膿杆（gǎn）菌核酸，這（zhè）種混（hún）淆會（huì）耗費大（dà）量精力和成本。

對於多數設施來說，使用（yòng）哨兵鼠方案（àn）則（zé）可以通過購買商業化試（shì）劑進行自檢，但如果使用（yòng）EHM方案，則（zé）需要進行PCR自檢（jiǎn），那很（hěn）可（kě）能由（yóu）於方法驗證不充分、實驗室條件（jiàn）不適宜、氣溶膠汙染（rǎn）等（děng）多種（zhǒng）因素造成（chéng）實（shí）驗結果的不可靠（kào）。如果將EHM樣本（běn）送檢專業第三方檢測機構，檢測成本則要（yào）明（míng）顯高於哨兵鼠（shǔ）檢測。盡管在哨兵鼠（shǔ）購買、飼養、樣本采（cǎi）集等方麵需要（yào）消耗更多（duō）資金和勞動力成本，甚至經過（guò）折算這部分成（chéng）本是高於（yú）支出的檢測費的，但相較於檢測費，這些成本更為“隱形（xíng）”。

由於標準更新的周期漫長（zhǎng），目（mù）前國（guó）標GB/T 14926中檢測病原微生物的主要方法是血清學方法、培養法和（hé）鏡檢法（fǎ），而極少提（tí）及分（fèn）子生物學方法（fǎ），這也使得不同實驗室間方法不統一，使得其推廣應用及不同機構間互認的阻礙（ài）增加。

展望

總而言之（zhī），目前在（zài）美國、加拿大、歐洲等國（guó）家和地區，EHM的驗（yàn）證（zhèng）和應（yīng）用越來越廣泛，已經（jīng）有少（shǎo）數設施完全取消了髒墊料哨兵鼠的使用，每年可減少數萬隻哨兵（bīng）動物的使用。我國開展驗證和應用EHM方（fāng）案的機構數量還十分稀少，但是也逐漸有越來越多的設施管理者開始關注並嚐試。所（suǒ）以短期內髒（zāng）墊料哨兵鼠還是會被廣泛應用，但是隨著管理人員對（duì）結果時效性、敏感性的要求的提高和方法的充分驗證，EHM一定會被更多使用，並逐步替代哨兵鼠方案。

參考文（wén）獻：

1. Luchins KR, Gates KV, Winn CB, Manuel CA, Pettan-Brewer C, Foley PL, Peterson NC, Garner JP, Hanson W, LaFollette MR. A Cross-sectional Survey on Rodent Environmental Health Monitoring Practices: Benchmarking, Associations, and Barriers. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2023 Jan 1;62(1):64-73. doi: 10.30802/AALAS-JAALAS-22-000086. PMID: 36755202; PMCID: PMC9936849.

2. https://na3rc.sharepoint.com

3. Winn CB, Rogers RN, Keenan RA, Gerwin PM, Matthews KA, Ramirez JA, Bennett TE, Perkins CL, Henderson KS. Using Filter Media and Soiled Bedding in Disposable Individually Ventilated Cages as a Refinement to Specific Pathogen-free Mouse Health Monitoring Programs. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2022 Jul 1;61(4):361-369. doi: 10.30802/AALAS-JAALAS-22-000013. Epub 2022 Jun 24. PMID: 35750479; PMCID: PMC9674011.

4. Mailhiot D, Ostdiek AM, Luchins KR, Bowers CJ, Theriault BR, Langan GP. Comparing Mouse Health Monitoring Between Soiled-bedding Sentinel and Exhaust Air Dust Surveillance Programs. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2020 Jan 1;59(1):58-66. doi: 10.30802/AALAS-JAALAS-19-000061. Epub 2019 Dec 20. PMID: 31862019; PMCID: PMC6978580.

5. de Bruin WC, van de Ven EM, Hooijmans CR. Efficacy of Soiled Bedding Transfer for Transmission of Mouse and Rat Infections to Sentinels: A Systematic Review. PLoS One. 2016 Aug 12;11(8):e0158410. doi: 10.1371/journal.pone.0158410. PMID: 27518654; PMCID: PMC4982683.