如前文《實（shí）驗（yàn）動物的常規眼科檢查》一文中所寫，眼（yǎn）科檢查的操作流程可因動物種屬和特點的研究目的而異。如果目的是篩查藥物等物質對（duì）眼部組織的不良影（yǐng）響，則應至少進（jìn）行間（jiān）接檢眼鏡和裂隙燈顯微鏡的檢查。根據檢查目的，也（yě）可執（zhí）行其（qí）它程序，比如角膜染色、角膜知覺檢查、角膜厚度測量、眼壓計、眼底照相（xiàng）、熒光血管造影、光學相幹斷層掃描 (OCT, Optical Coherence Tomography) 和視覺係統的電生理評估（例如（rú）視網膜電圖、多焦視網膜電圖、視覺誘發電位）。

許多無創性眼科（kē）診（zhěn）斷技術（shù），可同時提供眼前節與眼（yǎn）後節的結構和功能信息（xī）。下麵（miàn）討論了其中一（yī）些技術，對這些（xiē）技術適用於毒理學、眼科研究和（hé）臨床應用（yòng）的場景（jǐng）進行了初步討論。

01、眼壓測量（liàng）

眼壓計用於獲得（dé）眼內壓 (IOP, Intraocular Pressure) 的間接測量值。市麵上有幾種不同的商品化的手持（chí）式設備，其便攜性足以供眼科檢查人員使用，如（rú）壓陷、壓平或回彈式（shì）眼壓計。對於合同研發組（zǔ）織（CROs, Contract research organizations）使用的多種動物種屬，通常認為（wéi）Schiotz壓陷式（shì）眼壓計的結果（guǒ）不準（zhǔn）確、不（bú）可靠，因此不應用於眼部毒理學研究。由於許多眼（yǎn）壓計最初設計用於（yú）人的角膜，用（yòng）於動物的讀（dú）數可能略不（bú）準（zhǔn）確，但如果（guǒ）在整個研究期間由同一名檢查者使用相同的眼壓計，則研究中（zhōng）發生的眼壓變（biàn）化將是有（yǒu）效的。

大多數實驗動物的 IOP 範圍為 12-25 mmHg，雙眼之間（jiān）的差異應≤5 mmHg。IOP 可（kě）受到多個變量的影響，如：保定技術（shù）、動物應激（jī）、晝夜節律眼位、鎮靜或麻醉、角膜厚度等。如（rú）果可能，在進行眼壓（yā）測量時，應（yīng）在整個研究期（qī）間保持如下細節的（de）統一：每（měi）天相同的測量時間、相同的眼壓計和操作技術、同一組檢查人員和保定人員，來（lái）測量試驗內所有動物的 IOP。應在散瞳之前測定眼壓。當眼壓測量是研究（jiū）的關鍵點時，建議研究開始前先（xiān）對動（dòng）物進行保（bǎo）定適應和操（cāo）作（zuò）適應。

最常使用的是（shì）壓平式眼壓計，如（rú）Tono-Pen XL®、Tono-Pen Vet®、Tono-Pen AVIA® ，或非接觸式眼壓計。眼壓測量需表麵麻醉（zuì）時，0.5% 丙美卡因是最常見的選擇。該（gāi）技（jì）術測（cè）量壓平角膜給定（dìng）區域所需的力，然後將該施（shī）加力轉換為眼壓值（單位：mmHg）。一些壓平式眼壓計具有自我校準（zhǔn）的優勢（圖1），而非（fēi）接觸式眼壓計可（kě）提供紙質副本用於記錄保存，兩者都是藥物（wù）非臨床研究質量管理（lǐ）規範（GLP，Good Laboratory Practice）類研究（jiū）的理想技術。Tono-Pen XL 和 Tono-Pen Vet® 產生4個獨立讀數（shù），可對讀數取平均值，並顯示IOP和誤差百分比，即單（dān）個讀數之間變異性。Tono-Pen AVIA® 產生10 個獨立讀數，並以置信度百（bǎi）分比報告 IOP 和變異性。對於（yú） Tono-Pen XL®，誤差（chà）百分（fèn）比應（yīng） <5%，而對於 Tono-Pen AVIA®，置信度百分比應 >95%。

圖（tú）1  Tono-Pen AVIA Vet® 用於測（cè）量Dutch Belted Rabbit的眼（yǎn）壓

回彈式眼壓計通過向角膜發射（shè）一個（gè）小的塑（sù）料探針頭來確（què）定眼壓，然後探頭反彈回（huí）設備中，產生感應電流，由此計算眼壓值。為了準確測（cè）量（liàng），探針（zhēn）必須以水（shuǐ）平位置在（zài）角膜上擊發，即探（tàn）針與地（dì）板平行。實驗動物最常用（yòng）的回（huí）彈眼壓計是 Tonovet®（圖2a）。Tonovet® 專門針對犬、貓和馬進行了（le）校準，但也已在其（qí）它種屬中可靠地（dì）使用。TonoLab 眼壓（yā）計是專門為小鼠和大鼠設計和校準的（圖2b）。在許多實驗動物中，包括犬、兔和大鼠，Tonovet 和（hé） TonoLab 眼壓計具有不需要局部麻醉的優點，並且比 Tono-Pen® 更（gèng）容易獲（huò）得 IOP，其缺點是在使用前不能自行校（xiào）準。與 Tono-Pen® 和 Tonovet® 一樣，它也取6 個讀數的平均值，並使用眼壓值的左（zuǒ）側欄指（zhǐ）示誤差百分（fèn）比。測量時，應沒有錯誤欄（lán），或者欄應該位於屏幕的左下角，以使讀數可以接受。

無論使用何種眼壓計，通常每隻眼應獲得並記錄至少 2-3 個最終平均讀數。由於除非接觸式外的所（suǒ）有眼壓計僅給出數字讀數，設（shè）備不會創（chuàng）建（jiàn）永久性記錄，因此必須手動（dòng）記錄 IOP 或將其輸入計算機數據庫中。

圖2  (a) The Tonovet® 回（huí）彈式眼壓計測量New Zealand white rabbit眼壓  (b) TonoLab 眼壓計小小的尖端可（kě）用於齧齒類的眼壓測定

02、角膜厚度測量法

角膜厚度測量法是一種無創（chuàng）性評價角膜厚度的方法。 最常使用專門為此目的設計的接觸式超聲（shēng）設備（例（lì）如 PachPen®）進行（圖3），但也可以通過高（gāo）分辨率超聲檢查或光學相幹斷層掃描（miáo）（OCT, Optical Coherence Tomography）獲得角膜厚度的測量結果。在角膜水腫可被生物顯微鏡（jìng）檢測出之（zhī）前，角膜厚度測（cè）量法可對角膜厚度的細微變化進行評價。角膜厚度可因種屬（shǔ）的不同（tóng），以及（jí）角膜（mó）區域不同（軸向或周邊）而變化。由於區域差（chà）異，必須（xū）在每個時間點從角膜的相同區域進行測量，通常選用軸向。

圖3  PachPen 測（cè）量New Zealand white rabbit角膜厚度（dù）

03、熒光素染色法

在涉及（jí）眼局部給藥、角膜接（jiē）觸鏡評（píng）價的研究，和使用改良 Hackett-McDonald 評分係統的其他研究中，通常使用熒光素鈉溶液評價角膜上皮的（de）完整性。熒光（guāng）素是一種（zhǒng）水溶性（xìng）熒光染料，可被親水性角膜基質（zhì）保留，但不被角膜上皮（pí）保留（liú）。它可用（yòng）於輔助識別角膜上皮缺損，也可用於評價角膜前的淚膜滯留。熒光素以單個浸漬條帶的形式提供，使用時使用無菌生理鹽水潤濕。將濕潤的條帶輕輕塗抹在背側球結膜上（shàng），注意不要接觸角膜。然後使用鹽水輕輕衝洗多餘的熒光（guāng）素。或者，可將熒光素條置於塑（sù）料注射器中，並加入預定（dìng）體積的無菌（jun1）生（shēng）理鹽水，以產生已知熒光素（sù）濃度的溶（róng）液，然（rán）後（hòu）滴在角膜（mó）上（shàng）。由（yóu）眼科檢查（chá）人員使用帶有鈷藍（lán）濾光片的生物顯微鏡對角膜進行檢查，觀察是否有殘留的熒光（guāng）。

04、眼部照相

眼部（bù）照（zhào）相可用來證明（míng）眼底等區（qū）域無變化，或記錄異常以及監測病變的進（jìn）展。可在研究期間的不同時間點拍攝（shè）照（zhào）片來進行比較，以（yǐ）準確地確定異常是（shì）靜態的還是進行性的。由於照相增加（jiā）了額外的時間、成（chéng）本和動物應激，因此並非所有研究均需進行。在觀察到病變時，或很可能引起眼部異常的研究中（例如（rú）眼內植入物，玻璃體內或視網膜下注射研究（jiū）），可在（zài）研究方案中將其（qí）作為一種記（jì）錄病變的選擇。

眼部照相可分為眼外部和眼內部。眼外部的拍攝可（kě）使用帶有微距透鏡的標準單鏡頭反光（SLR, Single Lens Reflex）數碼相機（jī），或帶屈光（guāng）度設置（zhì）調（diào）節以允許眼外部和眼前（qián）節成像的（de）數（shù）字（zì） Kowa Genesis-D 眼底（dǐ）照相機。眼後節的拍攝（shè）需要特定類型的眼底照相機，數（shù）字化Kowa Genesis-D 照相機、RetCam、Phoenix Micron IV 和 Micron X 適用於大（dà）多數實驗動物（wù）的拍攝（圖（tú）4）。這（zhè）些照相機可適用於間接眼部照相、齧齒類（lèi）動物眼底照相和熒光血管造影。眼底照相的優點是能夠永久保（bǎo）存記（jì）錄，以比較潛在的研究相（xiàng）關結果，如果有（yǒu）發現，則可由另一名眼科檢查再次進行獨立審閱。

在拍攝照片時，所有照片都應使用相同的放大倍（bèi）率和照明設置。此外，所有動物均應按相同眼別順序（左和（hé）右）進行拍攝，同時應保存動物標識和設備日誌等（děng）拍攝記錄。上述標準也可作為標準操作規程 (SOP, Standard Operating Procedures) 的（de）一部分。

圖4  可用於實驗動物的眼（yǎn）底相機

05、熒光血（xuè）管造影

熒光血管造影可用於（yú）評價眼（yǎn）內（nèi）動脈和靜脈的血管完整性。雖然其最常用於檢查視網膜和（hé）脈絡膜的血管，但也可用於檢查虹膜血管。在毒理（lǐ）學研究中最常用於評價供（gòng）試品對於新生血管形成的影（yǐng）響。目前，它已被應用於多種（zhǒng）實驗動物，最常選用（yòng）的是10%熒光素鈉，也有部分研究選擇吲哚菁綠。

熒（yíng）光血管造影技術需要散瞳，並進行鎮靜或麻醉。將光可激發的化合物熒光素靜脈注射，可獲得目標組織（脈（mò）絡膜（mó）視網膜和虹膜）的一係（xì）列定時圖像（xiàng）。與熒光素注射相關的並發症可能包括（kuò）滲漏後組織刺激、嘔吐和過敏反應。必須在能夠拍攝多幅、快速排序圖像的眼底照相機（jī）上使用激發濾光片 (490 nm) 和屏障濾光片 (520-520 nm)。Kowa Genesis-Df、RetCam Shuttle、Phoenix Micron X 和 Heidelberg Spectralis cSLO 可用（yòng）於熒光血管造影，且是便攜式的（圖4）。在注射熒光素前，先拍（pāi）攝對照的彩色（sè）圖像（xiàng），然後每 20s 拍攝一組，獲得連續圖像。由於熒光素填充（chōng）脈絡（luò）膜視網膜血管，因（yīn）此描述了血管流動的（de）各個階段。它們包括（kuò）動脈前期（qī）、動脈期、動靜脈期、靜脈期及後期。熒（yíng）光血管造影觀察到的異常（cháng）可能包括血管異常（動脈瘤、新生血管形成）、熒光受（shòu）阻、熒（yíng）光素滲漏、低熒光（guāng）和高（gāo）熒光。

06、視網膜電圖/視覺誘發電位

根據毒理（lǐ）學（xué）研究目的，以（yǐ）及可能受影響的視覺係統的特定方麵，有（yǒu）多種電生理學試驗可（kě）用於評（píng）價（jià）視網膜和視覺通路。視網膜電（diàn）圖 (ERG, Electroretinography) 是測量視網膜在受到光刺激（jī）時產生的電勢。標準 ERG 是一種全（quán）視野刺激，可提供關於整個視網膜的（de）信息，是視網膜色素上皮、光感（gǎn）受器和內層視網膜的群體反應。對於局部視網膜評價（jià）可選用多焦視網膜電圖 (mfERG, multifocal electroretinogram)。對於黃斑區神經節細胞的評價（jià）可選用圖形（xíng）倒（dǎo）轉視網膜電圖 (PERG, pattern reversal electroretinogram)。而為了評價從視網膜到視覺皮層的整個視覺通路（lù），視覺誘發電位 (VEP, visual evoked potential) 則是首選（xuǎn）技術。在這些試驗中，全視野 ERG最常用於臨（lín）床（chuáng）前毒理學試（shì）驗。ERG 提供了一種非侵入性的可重複評估視網膜功能的方法，它可結合（hé）間接（jiē）檢眼鏡（jìng）和組織病理學來對視網膜（mó）結構和功能進行綜合（hé）評（píng）估。

ERG應在散瞳後（hòu）按標準流程進行，目（mù）前人和（hé）犬的ERG有許多可參（cān）考（kǎo）的國際指南，可作為（wéi）試驗設計的參考。在獲（huò）得（dé）全視野ERG過程中，如（rú）下條件建議保持一致：房間照明情況、暗（àn）適應、閃光強度、頻率以及使用的鎮靜（jìng）或麻醉劑劑量。

07、光學相幹斷層掃描

光學相幹斷層掃描是一種高（gāo）分辨率的無創成像技術，可提供眼部結構的實時橫斷麵圖像（xiàng），最常用於視網膜和視神經，其軸向分辨率為 2-10 μm，也可用於眼前節的（de）成像。與許多先進的成像技術一樣，它需要鎮靜或麻醉、散瞳（tóng）和專門的設備。當進行 OCT 成像時，可看（kàn）到所有的單個（gè）視網膜層，並（bìng）測量（liàng）其厚度，以便隨時間進行定量和多次重複評（píng）價。其（qí）可測量視盤的杯麵積、盤麵積、杯直徑、盤直徑以及邊緣麵積。通過 OCT 對前節進行檢查則可了解（jiě）角膜、前房、虹膜和虹膜角膜角的結構信息，且其無需像超聲生物（wù）顯微鏡 (UBM, ultrasound biomicroscopy) 所需的那樣接觸角膜。它還提供了（le）比 UBM更高的軸向分辨率。OCT 在實（shí）驗動物（wù）中已應用於多個種屬，其在人類疾病動物模型和臨床前試驗中（zhōng）的應用也將越（yuè）來越多。

隨著技術（shù）的進步，頻域 OCT (SD-OCT, spectral-domain OCT) 使用（yòng）非機械技術（shù），比傳（chuán）統（tǒng） OCT 或時域 OCT (TD-OCT, time-domain OCT) 明顯更快。SD-OCT 同時測量（liàng）一個光譜中多個波長（zhǎng）的反射（shè）光，因此被稱為光譜域。SD-OCT 比 TD-OCT 快 100 倍，每秒可采集 70,000 + 次 A-scan，其掃描速度和次（cì）數的增加可轉化為更高分（fèn）辨率。

08、角膜內皮顯微鏡檢查

角膜內皮顯微鏡可對角膜內皮細胞進行活體非侵入性的成像觀察，可采用接觸（chù）或非接觸方法進行。一旦可（kě）視（shì）化，可評價角（jiǎo）膜內皮細胞的細胞形態，並可定（dìng）量為每 mm 的細胞數量 。正常角膜內皮細胞（bāo）排列規則，呈六角形。內皮顯微鏡可（kě）評價細胞的密度（dù）、多形性（xìng）和變異情（qíng）況。由於細胞數量可因動物（wù）年齡和角膜區域的不同而變化，因此須使用相同年齡的動物對這些變量進行標準化，並檢查軸向角（jiǎo）膜。須對動物進行鎮靜或（huò）麻醉，以獲得準確（què）的圖像，並可適用（yòng）於簡化技術的自動化係統。FDA 已經設立了關於臨床試驗中角膜內皮顯微鏡檢查的（de）指南，這（zhè）些指南可以作為臨床前研究設計的起點。除角膜內皮（pí）顯微鏡外，還可選用體內高分辨率共聚焦顯微鏡 (Heidelberg Retina Tomograph with Rostock Corneal Module) 進行角膜內皮成像和分（fèn）析（圖5）。

圖5  Heidelberg Retina Tomograph (with Rostock Corneal Module)用於角膜內（nèi）皮的成像和分析

小結（jié）

在本篇文章中，我們總結了（le）在醫（yī）藥行業等研究場景中的（de）非常規眼科檢查的適當方法和技術。這些技術將在（zài）眼部毒理學領域中越來越普遍，技術人（rén）員可在研究過（guò）程中根據試驗的（de）設計和已發現的眼（yǎn）科學變化等關鍵因（yīn）素（sù），來選（xuǎn）用進一步的檢查辦法。

參考文獻

[1] Gilger B C, Cook C S, Brown M H. Standards for Ocular Toxicology and Inflammation [M].  2018.