2021年，經濟合（hé）作與發展組織（OECD）正式發布了一項具有裏程碑意義的測試指南——第497號（TG 497），首次將一（yī）套完整的綜（zōng）合（hé）體外測試方案納入國際毒理學評價體係，該方案用於化學品的皮膚致敏性評估，被視為（wéi）可完全替代動物實驗。緊接著，OECD於2022年又發布了另（lìng）一項綜合體外測試方案TG 467，用於評（píng）估（gū）眼部腐蝕與刺激。盡管（guǎn）目前僅有這（zhè）兩項指南作為完全替（tì）代相應動物實（shí）驗的方案被納入官方（fāng）毒理測試評價體係，但它們的推出仍標誌著在部分領域，非動物（wù）方法（fǎ）已由“輔助性工具”躍升為決策（cè）層麵的（de）主導手段，實現了特定毒（dú）理終點的完全替代（dài）。但正如TG 497的成功案例所揭示（shì）的那樣，實（shí）現“完全替代”的道路（lù）並非坦途——每一個被采納的替代方案都需要在對（duì）生物機製深入理解的基礎上（shàng），實現方法的標準化、完成多（duō）中心驗證及確保替（tì）代方案與人體真實反應的高度一致性。因此，目前替代成功更多是個別突破而非普遍（biàn）現象。在了解TG 497前，先簡要了解下皮膚致敏的過程和機理：化合物引發皮（pí）膚致敏反應主要涉（shè）及三個連續的生（shēng）物學（xué）過程。

首（shǒu）先，多數低分子質量（通常小於500道爾頓）的化學物質本身不能被免疫係統直接識別，因此（cǐ）它們（men）需（xū）首先與皮（pí）膚中的蛋白質發生共（gòng）價結合，形成所謂的半抗原複合物。這種修飾後的蛋白質結構被免疫係統識別為“外來”，成為真正具有免疫原性的抗（kàng）原，進而觸發（fā）遲發型（IV型）變態（tài）反應，即皮膚致敏反應的起點；

第二步是角質形成細胞的應激激活。在接觸化學物質後，表（biǎo）皮中的角質形成細胞會被刺激（jī）而激活，釋放一（yī）係列促炎因子，如各（gè）種白細胞介素（sù）和胸腺基質淋巴細胞生成素等。這些細胞因子的釋放不僅增強局部炎症反應（yīng），還具有重（chóng）要的免疫信號功能，可吸引並激活（huó）樹突狀細胞及朗格漢斯細胞向接觸部位遷（qiān）移（yí）；

第三步（bù）是樹突狀細胞的激活與抗原提呈。這些抗原遞呈細胞在接觸刺激（jī）部位攝取半抗（kàng）原複合物後，成熟並遷移至區域性淋巴結，在那裏與T細（xì）胞相互作用，完成抗原提呈，最終形成免（miǎn）疫記憶。該免疫記憶使得（dé）個體在後續（xù）暴露相同化（huà）學物質時迅速出現過（guò）敏反應，表現（xiàn）為典型的（de）過敏性接觸性皮炎。

從皮膚首次（cì）接觸某種化學物質（zhì），到反複暴露後誘發（fā）過敏性接觸性皮炎的全（quán）過程，在現代毒理學中被統（tǒng）稱為“有害結局通路”。該通路由多個生物學過程構成，其中的關（guān）鍵環節（jiē）被稱為“關鍵事（shì）件”。由上文可知，皮膚致敏的有害結局通路包含三個關鍵事件，即（1）半抗原形成；（2）角質形成細胞的激活和（3）樹突（tū）狀細胞激活。在所（suǒ）有已知的“有害結局通路”中，皮膚致敏性“有害結局通路”是（shì）建立最早（zǎo）、機製最明確，且相對（duì）容易進行體外模擬的免疫反應，因（yīn）此成為了替代方法開發的突破口。

在傳統毒理學評估中，皮膚致敏性通常依賴動物整體反應模型進行判斷，代（dài）表性方法包括：（1）豚鼠皮膚致（zhì）敏試驗，用於綜合評（píng）估致敏起始階段與激（jī）發階段的反應；（2）局部淋巴結試驗，聚焦於皮（pí）膚（fū）致敏階段。以局部（bù）淋巴結試（shì）驗為例，一次標準實驗需消耗至少20隻（zhī）小鼠。據統計，截至2018年，僅在歐盟REACH製度實施框架下就已有超過33,000隻小鼠被用於皮膚致敏性測（cè）試。

那麽TG 497中所列（liè）的動物替代技術是如何實現（xiàn）的呢？TG 497 所采用的“三選二策略”是基於（yú）皮膚致敏性有害結局（jú）通路中的前三個關鍵事件所構建的一種綜合性評估方法，旨（zhǐ）在（zài）判定受試化學物是（shì）否具有皮膚致敏潛力。

首先，直接肽反應實（shí）驗（DPRA，OECD TG 442C）用於評估第一關鍵事件，即被測物是否具有與蛋白質共價結合形成半抗原的能力。該方法采用合成的含半（bàn）胱氨酸（suān）或（huò）賴氨酸殘基的（de）肽段作為模型受體，與被測物（wù）共同孵育後，通過測量（liàng）肽的消耗率評估其反應性。反應結束後，利用高效液相色譜（pǔ）對肽段殘（cán）留量進行定量分析。若（ruò）肽的消耗顯著，說明化學物能與肽發生共價反應（yīng），具備潛在（zài）致敏性，從（cóng）而完成對半抗原形（xíng）成關鍵（jiàn）事（shì）件的（de）評價。

其次，角質形成細胞激活試驗（KeratinoSens™, OECD TG 442D）用（yòng）於評估第二關鍵事件——角（jiǎo）質形成細胞的氧化應激與促炎反應（yīng）激活，該事件（jiàn）在有害結局通路（lù）中處於信號放大的早期階段。KeratinoSens™方法（fǎ）基於轉基（jī）因（yīn）人永生化（huà）角（jiǎo）質形成細胞係HaCaT，該細胞穩定表達一個（gè）由抗氧化（huà）反應元件驅動的（de）熒光素酶報告基因。當潛在致敏物（wù）質刺激角質形成細胞時，會引發細胞內應激響（xiǎng）應，從（cóng）而啟（qǐ）動熒光素酶（méi）表達（dá）。通過測定熒光素酶活性，即可定量評估化學（xué）物對該通路的激活能力，進而（ér）判斷其是否誘導角質形成（chéng）細胞釋放促炎因子。

最後，人源樹突狀細胞活化實驗（h-CLAT，OECD TG 442E）模擬有害結局通（tōng）路中的第三（sān）關鍵事（shì）件——樹突狀細胞的激活。在致敏過（guò）程中，被測物通過局部炎症信號激活樹突狀細胞（bāo），後者在抗（kàng）原識別、處理及向T細（xì）胞提呈抗原的過程中起到橋梁作用（yòng）。h-CLAT方法使（shǐ）用人急性單核細胞白（bái）血病細胞係THP-1作為樹突狀細胞（bāo）的替代模型。當（dāng）致敏化學物作用於THP-1細胞後，若（ruò）具免疫激活能（néng）力，將誘導其表麵共（gòng）刺激分子（如CD86和CD54）表達上調。通過流式細（xì）胞分析檢測這些（xiē）表麵（miàn）標誌（zhì）物（wù）的相對熒光強度變化，即可判斷化學物是否具備激活免疫係（xì）統的潛能。

TG 497通過整合上述三種機製互補的（de）體外方法，從生物學不同層麵綜合評（píng）估皮膚致敏性。隻要（yào）任意兩項測試結果一致，即（jí）可做出科學、可靠的（de）致敏性（xìng）判斷，從而實現在此毒理終點上對動物實驗（yàn）的完全替代。這三項方法各自針對皮膚致敏有害結局通路中（zhōng）的不同關鍵節點，組（zǔ）合使用（yòng）時（shí）增強了判斷的穩健性和預測一（yī）致性。

TG 497被正式寫入OECD指南前，其開（kāi）發團隊以及歐盟替代方（fāng）法驗證中心（xīn）、美國替（tì）代方（fāng）法驗證協調委員會和日本替代方法驗證（zhèng）中心都對其（qí）評估能力進行了驗證，並與傳統動物實驗方法如局部淋巴（bā）結試驗做了對比，結果顯示TG 497在多個核心（xīn）指標上全麵優於局部淋巴結試驗。具體表現為：在敏感性（xìng）上，TG 497達到了87%，相比之下局部淋巴結試驗為72%，證明前者在識別真正致敏物方麵（miàn）表現更優；在特異性方麵，TG 497為88%，也明顯高於局部淋巴結試驗的75%，證明其在排除（chú）非致敏物時誤判更少；在準（zhǔn）確率上，TG 497為87.5%，也高於局部淋（lín）巴結（jié）試驗的73%，證明其在整體預測效能上表現更加平衡；更為關鍵的是，與人體不良反應數據的一致性（xìng）上TG 497達到（dào）了“非常（cháng）高”，而局部淋巴結試驗僅為“中等偏高”，這表明TG 497在臨床相關性上更具優勢。

綜上所述，TG 497不僅在科學性能（néng）上更為出色，而且由於其不依賴動（dòng）物實驗、與人體數據（jù）一致性更高，因此得以成為目前首個被國際監管機構（gòu）OECD采納的完全替代皮膚致敏性動物試驗的標準體外測試方案。這（zhè）一指南的頒布也標誌著毒理學替代方法從“輔助”邁入“決（jué）策級”應用的關鍵進展。

盡管TG 497的成功被視為替代毒理學領域的重要裏程碑，但其背後反映出的研發過程也（yě）暴露了動物替代方法開發的諸（zhū）多難點與局（jú）限。之所以能取得突破，首先因為皮（pí）膚致敏反（fǎn）應是目前有害結局通路（lù）建立最（zuì）完善的毒理路徑之一，機製簡單、事件明確、模擬容易（yì）。相比之下，神經毒性、免疫（yì）毒性、內分泌幹擾等終點路徑複雜，機製不明確，至今尚無可實現完全替代的體外組合方法。其次，TG 497研發成功的核（hé）心優勢還在（zài）於擁（yōng）有有大量來（lái）自（zì）因斑貼測試、臨床案例和職業暴露的人體皮（pí）膚致敏不良反應數據（jù）可用於方法驗證。而多數其它毒理（lǐ）領域（yù）仍嚴重依賴於動物實驗數據，缺乏可（kě）比對的（de）人體資料，從而限製了相應替代方案的實際驗證路徑。即便如此，TG 497成功進入OECD指南也曆經（jīng）了漫長的驗證、標（biāo）準化與互認過程。三項子方法最早提出可追溯至（zhì）2006年（nián）前後，但直至2015年才以單（dān）獨測試（shì）方法形（xíng）式（shì）被 OECD 采納，2021年方（fāng）整合為 TG497——整個流程耗時逾10年。

此外TG 497在皮膚致敏評估中仍存（cún）在化學品適用（yòng）範圍的盲區：它僅適用於小分（fèn）子化學品，對金屬離子、複雜混合物、親水性或高反應性物（wù）質尚不適用；同（tóng）時，也不適用於易幹擾（rǎo）測（cè）試係統穩定性的強刺激性或腐蝕性化合物。

可以說，TG497 的（de）誕生既是一道分水嶺，也是一麵（miàn）鏡（jìng）子：一方麵，它首次證明“綜合測（cè）試方案”完全可以（yǐ）獲得（dé）監管層（céng）麵的認可，為 OECD 體係（xì）內其他毒理終點（diǎn）開發類似方（fāng）法樹立了範式；另一方麵，它警示我們，唯（wéi）有深入掌握生物機製、係統整合多源數據並實（shí）現方法標準化與多中心驗證，替代策略方能真正（zhèng）落地。更進一步，TG497 的成功（gōng）表明，替代路徑更適（shì）用於（yú）機製清（qīng）晰、易（yì）於體外模擬且人體數據相對充足的毒（dú）理終點。總之，替代並非簡化，不是單憑熱情就可（kě）以“一蹴而就”的，而是在更高科學規範（fàn）要求下，通過持續演化與完善才能夠得以實現；同時，其研（yán）發仍離不開動物實驗與人體反應數據的對照（zhào）與支撐。因此，盡管TG497 為全麵替代動物實驗開了一個好頭，但在所有領域都實現這一目標仍有漫長的科學探（tàn）索與製度（dù）建設之路要走。