滴眼給藥毒性試驗的目的

滴眼給藥毒性（xìng）試驗是重複給藥一般毒性試驗，主要用於研發滴眼藥（yào）物。歐盟發布的《醫療用品非（fēi）臨床局部耐受性試驗指導原則》（CPMP/SWP, 2001）明確規定了單次給藥和重（chóng）複給藥眼部耐受性試驗的相關事宜（yí）。美國食品藥品監（jiān）督管理局發布的《藥品以及可替代性給藥藥品非臨床（chuáng）安（ān）全性評價指導原則草案》（FDA/CDER, 2008）則明確要求在滴眼給藥時應（yīng）開（kāi）展（zhǎn）係統藥代動力學（PK）和眼科檢查（包括裂隙燈顯（xiǎn）微（wēi）鏡檢查、眼底（dǐ）檢查、眼壓測量及組織病理學檢查）。然而，這兩份指導原則中的（de）相關規定均較簡要，缺乏滴眼給藥毒性試（shì）驗詳細設計的具體內容（róng）。目前，尚無滴眼給藥毒性試驗的（de）確切定義。日本（衛生福利（lì）部，1999）依據ICH M3指導原則（zé）（ICH, 2009）和ICH S4指導原則開展滴眼給（gěi）藥毒性試驗。這些原則通常（cháng）適用於係統給藥的藥物。

有人常常將滴（dī）眼給（gěi）藥毒性試驗與眼刺激試驗混為一談。實際上，滴眼毒（dú）性預試驗、一周（zhōu）或兩周的（de）重複給藥（yào）滴眼毒性試驗的方案與眼（yǎn）刺激試驗的方案有（yǒu）相似之處（OECD, 2012）。

目前，眼刺激試驗通常（cháng）使用兔子（zǐ）進行，以評估化學物質在粘膜給藥或人體偶然接觸時的安（ān）全性（OECD, 2012）。眼（yǎn）刺激試驗的主要目的（de）是檢測眼表的刺激或腐蝕反應。

相（xiàng）比之下，滴眼給（gěi）藥（yào）毒性試（shì）驗的主要目（mù）的（de）是評（píng）估眼科藥物的一般毒（dú）性。因此，滴眼給藥毒（dú）性試驗（yàn）的檢查項目包括組織病（bìng）理（lǐ）學檢查、眼部附屬器以及全身髒器的評價。這兩種試驗的差異見（jiàn）表1。

表1 滴眼給藥毒性試驗和眼刺激試驗的差異

滴眼給藥毒性試驗的設計（jì）

01、動物物種

根據（jù）ICH M3指導原則，一般毒性試驗需（xū）選擇兩種（zhǒng）動物（ICH, 2009）。通常情（qíng）況下（xià），會從齧齒類動物（如兔或小鼠（shǔ））和非齧（niè）齒（chǐ）類動物（犬或猴）中各選（xuǎn）一種。然而，在過去十年間（2005~2016），經日本衛生勞動福利部（MHLW）批準，約九（jiǔ）成的滴眼液在研發過程中，將兔作為開展滴眼給藥毒性試（shì）驗（yàn）的（de）首選實驗物種，其次常用的實驗物種是（shì）猴（幾乎全部是（shì）食蟹猴），再然後是犬（見表2）。因（yīn）此，滴眼給藥毒性試驗（yàn）通常選擇（zé）兩種非齧齒類動物。不過，動物物種的選擇是根據具體情況而定的。因此，在評估某些藥物時，可能僅（jǐn）使用一個物種（比如兔或食蟹猴）。

表（biǎo）2 2005~2016日本滴眼液滴（dī）眼給藥毒性試驗的獲批的動物物種 

注：信息來源（yuán）於日（rì）本醫藥和醫療器械（xiè）局（jú）（PMDA）主頁

近來發表的多篇文章從眼部（bù）安全性（xìng）評（píng）估的角度出發，討論了各個實驗物種的特點，並對不同實（shí）驗物種作了比較。各物種的特點如下。

兔

兔的眼球（qiú）重量約為人眼的一半，眨眼頻率（每6分（fèn）鍾一次）明顯（xiǎn）低於人類的（de）眨眼頻率（每（měi）5秒鍾一次）。此外，兔的角膜比人（rén）類的角（jiǎo）膜薄。基於這些特點，並考慮到影（yǐng）響藥物角膜滲透能力的因素，有研究者預計，在滴入滴眼（yǎn）液後，兔眼的藥物暴露水平相對較高。McDonald和Shadduck（1977）認為兔相較於其他實驗動物對眼刺激物更為敏感。使（shǐ）用兔進（jìn）行試驗的其他原因還包括較低（dī）的動物成本以及基於大量供試（shì）品積累的曆（lì）史數據。

在進行（háng）滴眼給藥毒性試驗（yàn）時，特別需注意選擇色素兔還是白化兔。由於供（gòng）試（shì）品能夠與色素兔體內的色素（sù）結合，因此在毒性評估時（shí），色素兔更具（jù）優勢。關於色素兔（tù），荷蘭帶兔比新西蘭大白兔和新西蘭紅兔（F1代兔）更（gèng）常用於（yú）滴眼給（gěi）藥毒性試驗。Durairaj等人（2012）報告稱，人（rén）、食蟹猴、犬、豬、F1代兔和荷蘭帶兔的眼部黑（hēi）色（sè）素含量存在差異（yì），而且不同物種之間眼睛各部分的黑色素含（hán）量也不同。另外，值得（dé）一提的（de）是，荷蘭帶兔（tù）的眼球比新西蘭大白兔（tù）或日本白兔的小。

猴

盡管食蟹猴的眼球重量僅約為人眼的（de）一半，但其解剖（pōu）特征與人類相似。例如，食蟹猴的角膜和晶狀（zhuàng）體相（xiàng）對較小，眼底有黃斑。Shibuya等人（2015）建議將食蟹猴用作實驗動物，因（yīn）為它（tā）們的眼睛有助於詳細評（píng）估藥物誘（yòu）導的黃斑病變毒性。食（shí）蟹（xiè）猴的眨眼頻率與人類相似。與人類一（yī）樣，食蟹猴（hóu）既沒有瞬膜，也沒有哈氏腺，而兔、犬和（hé）豬（zhū）則都有瞬膜和哈氏腺。食蟹（xiè）猴和犬（quǎn）一樣，也用於係（xì）統毒性試驗。利用相關物種可以獲得毒理學數據，彌合局部給藥和係統（tǒng）給藥在同一物種中產生的結果差異。與人類相比，食蟹猴的（de）眼組織黑色素含量相對較高。在猴類中，視神經退化常見於恒河猴和食蟹猴，且（qiě）被認為是自發性先（xiān）天視神經病變。

犬（quǎn）和豬

針對特定目的飼養的比格犬（quǎn）的眼球重量約為（wéi）5.5克，約為人眼重量的0.8倍，而（ér）豬的眼球大小接近人眼。從眼球（qiú）的絕對尺寸來看，犬和（hé）豬在藥物局部效應（yīng）評估方麵具有優勢，因為眼組（zǔ）織的厚度和長度是決定局部給藥藥物滲透性和分布的（de）重要因（yīn）素。犬（quǎn）和豬的眼部解剖特征相似，例如，與靈長類動物相比，它們的晶狀體在眼球中占據的體積相對（duì）較大。另一方麵，犬的脈（mò）絡膜上有毯氈層，而豬（zhū）、兔或食（shí）蟹猴則沒有。目前，犬和豬不常用於滴眼給藥毒性試驗，尤其（qí）是豬。然而，這類（lèi）動物在滴眼給藥毒性試驗中仍有其獨特的優勢，理由如下：1. 基於上述解剖和生理特點，模仿（fǎng）人體藥物分布的可能性較高。2. 與兔和食蟹（xiè）猴（hóu）相比，由於犬和（hé）豬（zhū）的體型相對較大，通過係統給藥出（chū）現的藥物反應更少。

02、性別

根據一般毒性試驗指導（dǎo）原則（衛生福利部，1999），滴眼給藥毒性試驗應在兩種性（xìng）別的動物上進行。人類、恒河猴和兔的眼軸（zhóu）長度存在性別（bié）差異，但眼球尺寸的性別差（chà）異卻極其微小。Wagner等人（2008）研究了健康人眼和患病人眼的性別（bié）差異，認為性激素影響了不同性別在患病狀態下的淚腺係統、眼瞼和眨眼頻率（lǜ）、以及角（jiǎo）膜的解剖和特征。一般而言，幹眼（yǎn）流行病（bìng）學研究表明女性幹眼發病率比男性高（gāo）。然而（ér），實驗動物的眼睛是否存在顯著（zhe）的性別差異（yì）尚不明確。是否（fǒu）在滴眼給藥毒性試驗（yàn）中使（shǐ）用兩種性別，尤（yóu）其（qí）僅進行眼毒性評估的試驗，仍有待進一步討論。

03、給藥

劑量和濃度

根據（jù）ICH M3指（zhǐ）導原則（ICH，2009），一般毒性試驗的高（gāo）劑量水平設定為最大耐受量（MTD）、最大給藥量（MFD）或人體暴露量的（de）50倍。這一設定原則（zé）同樣適用於滴眼給藥毒性試驗。在某些情況下，高劑量水平可以基於局部（bù）耐受（shòu）性預試驗的結果（guǒ）來確定。然而（ér），在大多數情況下，滴眼給藥毒性試驗的（de）高劑量水平是根據MFD設（shè）定的，主要是（shì）由於製劑（jì）製備的某些內在因素。

供試品的（de）角膜滲透性主要取決於製（zhì）劑的特性。為了獲得有意（yì）義的風險評估結果，權威性滴眼給藥毒性試驗（例如首次人體試驗之前開展的GLP試驗（yàn））所用的供試製劑應與臨床試驗所用（yòng）的製劑（jì）一致或相近。供試品（pǐn）的濃度主要是根據（jù）其在製劑中的溶解度來定義的。至於製劑的調整，其他特性（如滲透壓、pH值和（hé）賦形劑）也十分（fèn）重（chóng）要。滴眼液製劑的酸堿度應在（zài）可接受的生理範圍內。選擇防腐（fǔ）劑時，需避免其濃度達到引起毒性反應的水平。例如，有研究者發現，眼科製劑中常用的（de）防腐劑苯紮氯銨（ǎn）在局部給藥時會誘發角膜變化。因此，眼科製劑中（zhōng）防腐劑的濃（nóng）度是有限（xiàn）製的。因此，在（zài）大多數情況（kuàng）下，滴眼給藥毒性（xìng）試（shì）驗所設（shè）的最（zuì）高劑量水平是基於（yú）受試製劑的最大給藥量，而非供試（shì）品本身的特（tè）性（xìng）來決定的（de）。

滴眼（yǎn）體積（jī）

兔子的眼（yǎn）瞼較為鬆弛，結膜囊較大，因此能容納較（jiào）大的滴眼液體積。根據OECD眼刺激試驗（yàn）指導原（yuán）則，兔子的滴眼體積為0.1 mL（OECD, 2012）。該體積約為（wéi）臨（lín）床標（biāo）準（zhǔn）滴眼液用藥體積（jī）（約0.04 mL）的兩倍。從經驗（yàn）來看，不同物（wù）種的最（zuì）大滴眼體積並不相同。例如（rú），比格犬（quǎn）和兔子的最大可行體（tǐ）積相似（sì），而食蟹猴的最大可行體積（jī）則是比格（gé）犬（quǎn）和兔子的兩倍多。

需（xū）注意的是，眼部（bù）暴露量（liàng）並不會隨著滴眼體積的增加而成比（bǐ）例增加，因為部分多餘的液體會通（tōng）過鼻（bí）淚管流失。Lambert等（1993）假定（dìng）在眼刺激試驗中，如果滴眼體積為（wéi）0.01 mL（建議供試體積的十分之一），藥物與（yǔ）人眼刺激（jī）感受的相關性更佳。因（yīn）此，滴眼給藥毒性試驗的滴眼（yǎn）體（tǐ）積可能（néng）需進一步討論。增加滴（dī）眼體積並不能有效提高眼部暴露量，反而可（kě）能導致係統暴露量增加，甚至引發意料之外的係統毒性反應。

單眼/雙眼給藥

供試品是單眼給藥還是雙眼給藥需慎重考慮。從動物福利的角度出發，若無特殊原因，應將供（gòng）試品滴入單側眼（yǎn）睛。如一隻眼給予供試品，另一隻眼（yǎn）則不給藥（即不接觸供試（shì）品），或給予對（duì）照（zhào）品（例如溶媒製劑）作為對照。然而，嚴格來說，對（duì）照眼由於（yú）係統循環的影響，可能也會接觸到供試品（pǐn）。因此，在評（píng）估對照眼（yǎn）的結果時，應該考慮到這一潛在的接觸因素。

給藥（yào）頻率

在標準的口服（fú）或靜脈給藥一般毒性試驗中，通常每天給藥一次；而在（zài）滴眼給藥毒性試驗中，通常一天給藥多次。非臨床試（shì）驗的滴眼頻率通常高於臨床試驗的給藥頻率。例如，非臨床試驗中可能每天滴（dī）眼4次，而臨床試驗中則每天滴眼2次。滴眼給藥毒性試驗設定較高的給藥頻率，旨在獲得更高的重複暴露量，特別是在（zài）供（gòng）試品的（de）生化特征導致最大藥物濃度難以增加時更為重要。Chrai等人（1974）報告稱，如果兩次（cì）滴眼間隔（gé）5分鍾，就（jiù）能有效地增加兔的眼部暴露量（liàng）。許多滴眼給藥毒性試驗（yàn）的給藥頻率是臨床給藥頻率（lǜ）的1.5到2倍。然而，給藥過（guò）於（yú）頻（pín）繁雖可提高暴露水平，但也增加操作的次數，從而增加動物保定的頻率，這可能導致動物應激（jī），進而引發倫理問題。因此，在設計滴眼給藥毒性（xìng）試（shì）驗時（shí），需在提（tí）高暴露水平和減少動（dòng）物應激之間（jiān）找到平衡點，以確保試驗的科學性和倫理性。

04、眼及（jí）附屬（shǔ）組織檢查

常規/標準眼科學檢查

滴眼給藥毒（dú）性試驗目前尚（shàng）無統一的眼部和係統檢查項目（mù）。OITSs的眼科學（xué）檢查（chá）是（shì）基於（yú）係統（tǒng）藥物一般毒性評估指導原（yuán）則（zé）進行（háng）的（de），涵蓋了（le）眼前節（jiē）、眼內介質和（hé）眼底等所有組織的檢查（ICH, 1999）。然（rán）而，由於滴眼給藥直接作用於眼部，滴眼給藥毒性試驗的眼科（kē）學（xué）檢查更加（jiā）詳細，涵蓋的檢查項目也更多。Weir和Wilson（2013）列出（chū）了（le）非（fēi）臨床眼（yǎn）毒（dú）性試驗的（de）標準眼部安全（quán）性終點，這些終點（diǎn）具有重要的借鑒意義。檢查項目包括：大體觀（guān）察、裂隙燈生物顯微鏡檢查、眼底檢（jiǎn）眼鏡檢查、眼壓測量、視網膜電圖和組（zǔ）織病理學。

基於相關（guān）指導原則和知識，表3總結了滴眼給藥（yào）毒性試驗的常規及（jí）可選（xuǎn）眼科檢查項目（mù）。由於（yú）眼前節的供試品濃（nóng）度較高，因（yīn）此對（duì）眼前節進行（háng）觀察和檢查尤為重要。除（chú）標準的大體觀察外，采用評分方（fāng）法進行詳細觀察對於評估眼毒性的（de）嚴重程度（dù）非常關（guān）鍵。例如，Draize評（píng）分法用（yòng）於角膜、虹膜和結膜的大體觀察。McDonald Schadduck評分（fèn）和Hackett-McDonald評分常應用（yòng）於滴眼給藥毒性試驗（yàn）中，二者對裂隙燈顯微鏡檢查結果進行評分。特別是，Hackett-McDonald評分能對眼睛進行全麵評估，包括對晶體和瞳（tóng）孔光反射的評估。

表3 滴眼給（gěi）藥毒性試驗的常規或可選眼科學檢查

常規檢查包括利（lì）用檢眼鏡對玻璃（lí）體和眼底進行觀察。使用直（zhí）接檢眼鏡和間（jiān）接檢眼鏡可詳細檢查眼底。本原則建議，除拍照（zhào）外，還應簡述檢查結果並記錄，並將這些記錄與相應的詳細記錄一同保存。

眼壓（yā）是衡量前房角功能變化（huà）的重要參數。FDA指導原則提到了使用眼（yǎn）壓計的方法（FDA/CDER，2008）。在非臨床毒性試驗中，常用扁平眼壓計、回彈式眼壓計或空氣式眼壓計（jì）來測量眼壓。在（zài）滴眼給藥毒性（xìng）試驗（yàn）中，使用眼壓計（jì）有幾點注意事項。首先，為了獲得準確的眼壓值，有必要使動物適應眼壓計。在測量之前（qián），如果動（dòng）物沒有適應眼壓計，通常情況下測出的眼壓值會偏高（gāo），從而導致無法正確判（pàn）斷藥效。其次，由於儀器會接觸角膜表麵（miàn），眼壓測量操（cāo）作可能會在某種程度上（shàng）損傷角膜上（shàng）皮細胞（bāo）。因此，應慎重決定檢查的組別及檢查順序，以避免眼部過度應激，並防止過度（dù）應激影響其他結果的解讀。

通過全視野視（shì）網膜電圖檢查（chá）（ffERG）可檢（jiǎn）測視網膜的功能變化。理想的做法是使用國際臨床視覺電生理協會（ISCEV）建議的方法，因為此方法可在進行全視野視網（wǎng）膜電圖檢（jiǎn）查時識別視錐細胞和視杆細胞的變化。然（rán）而，此方（fāng）法不適用於在有限時間內對大量動物進行檢查（chá）的情況。ISCEV方（fāng）法擬用於（yú）隨診檢查，可能僅適用於ERG檢查發現異常（cháng）的情況。例如，Penha等人（2010）報告稱，角膜（mó）混（hún）濁或晶體混濁會影（yǐng）響光線到達視網（wǎng）膜，而麻醉也會影響全視野視網膜電圖的檢查結果。

可選（xuǎn）檢查

關於淚膜檢查，Schirmer試驗和酚紅線試驗用於（yú）淚液體積的定量分析。進行Schirmer試驗和酚紅線試驗（yàn）時（shí），分別使（shǐ）用無毒濾紙或棉線浸潤於pH指示劑酚紅溶（róng）液中，然後（hòu）插入結膜囊內進行淚膜檢測。淚膜的其他臨床檢查包括淚膜破裂時間。此前已有研（yán）究者報告了犬和兔的淚膜（mó）破裂時間，這些測試（shì）能夠揭示淚腺（xiàn）的功能狀態。此（cǐ）外，眨眼頻率也可以（yǐ）間接說明供試品是（shì）否對角膜產生了刺激。

由於眼科成像技術的進步，現在能檢（jiǎn）測出常規眼科學檢查難以察覺的變化。例如，角膜共焦顯微鏡檢查能夠捕捉到角膜上皮的細微變化；角膜內（nèi）皮顯微鏡（jìng）檢（jiǎn）查能（néng）夠觀察到角（jiǎo）膜內皮的形態和密度變化；光學相幹斷層掃描（OCT）對於視網膜的觀察非常有力。這些成像技術均可用於滴眼給藥毒性試驗中的動（dòng）物檢查，能夠生成高分辨率的圖像，滿足組織病理學檢查的要求。

滴眼給藥毒性試驗的其（qí）他常用眼前節檢查包括定量測量角膜厚度的測厚儀和定量測量前（qián）房房水閃輝（huī）的激（jī）光房水閃光細胞（bāo）儀。如果眼後（hòu）節的視網膜出現局部異常，多焦視網膜電圖（mfERG）能夠捕捉到相應的電生理信號。利用眼底血管熒光造影能夠觀察（chá）到視網膜和脈絡膜的原有血管（guǎn）及新生血（xuè）管（guǎn）的滲透性。

Kontadakis等人（2014）指（zhǐ）出，淚膜中的細胞因子和生長（zhǎng）因子作為生物標記物，能預示（shì）眼表疾病。有研究者報告稱，血清細胞因子是預示老年黃斑變性的生物標記物。生物標記物能用於非（fēi）侵入性方式觀察藥物誘導的眼毒性（xìng）反應。然而，目前這樣的生物標記物數量仍然有（yǒu）限。反過來，上述（shù）的各種眼部成像技術可能可（kě）替代生物標記物，用於觀察和研究人和動物的眼毒（dú）性。

05、眼及附屬組（zǔ）織的病（bìng）理學（xué）檢查

組織病理檢查是滴眼給藥毒性試驗的（de）重要組成部分。最近，多篇（piān）文獻綜述（shù）一致強調（diào）了組織（zhī）病理學檢查在藥物評（píng）估（gū）中的重要性。在滴眼（yǎn）給藥（yào）毒性試驗中，供試品（pǐn）的（de）最大暴（bào）露量不僅出現在角膜上皮，還出現在結膜和排泄係統（tǒng），包括鼻淚管的粘膜和鼻腔。因此（cǐ），需要特別注意細致檢查這些組織。淚腺（xiàn）、哈氏腺（若有）、鼻（bí）腔和瞬膜（若有）也應進行組（zǔ）織病理學檢查（chá）。為了準確地進行組織（zhī）病理學評（píng）估分析，必須嚴格考量組織病理切片的質（zhì）量（liàng）。如今已（yǐ）有多（duō）篇關於這一方麵的（de）文章發表，詳細闡（chǎn）述了切片的各種技術考量。